AFM在植物生物大分子研究中的应用

AFM是利用光杠杆原理产生的光束偏转技术研制而成的。在一个对形变极为敏感的微悬臂(cantilever)的一端安装纳米级的针尖,扫描时样品和针尖存在力的相互作用,使微悬臂产生形变,导致从针尖背面反射到四象限检测器的激光束发生微弱变化,继而产生电压差,最后将这些电压信号转换为图像。AFM共由偏转检测系统、探针、扫描系统(压电陶瓷)、反馈系统和显示系统五部分组成。用于分析的模式有接触模式(contactmode)和振荡模式(oscillatingmode)两种成像模式和一种力模式(forcemode)。使用接触模式进行扫描时,针尖与样品相互接触,所成的图像具有较高的分辨率,通常用来检测样品的物理属性,由于剪切力的存在,对样品有一定损伤,很少用于探测生物样品。振荡模式是靠声学(tappingmode)或磁力(magneticalty)驱动,针尖和样品只有短暂接触,作用力较小,常用于生物样品成像。与前两种模式不同,力模式不能用于成像,而是用来测量针尖与样品表面之间相互作用力。探针是AFM的重要部件,探针的好坏直接决定着实验的成败。探针因生产厂家而异,主要有Si针尖、Si3N4针尖和最近几年发展起来的碳纳米管针尖(国立秋等,2003)等几种类型。因为探针的形状、力常数、固有频率等参数不同,适合的工作范围也不同,应根据实验需要甄选。

DNA是生命体的主要遗传物质,研究它的结构和功能,有利于了解生命过程中遗传信息的储存和传递过程。Lindsay等(1989)率先用AFM对DNA分子进行了观察。随后,科研人员对DNA的AFM成像进行了大量的研究(Weisenhornetal.,1990;Hansmaetal.,1991)。现在关于DNA的实验日臻完善,刘志国等(2005)运用了二价阳离子和3-aminopropyltriethoxysilane(APTES)修饰的云母来固定DNA分子,给出了用于DNA分子成像的合适的DNA浓度和二价离子浓度,在不同的APTES修饰云母的方法中,液相溶液修饰的方法能获得较好的效果;当使用较高浓度的DNA分子成像时,观察到了DNA的网络;展示了一种简单的伸展长链DNA分子的方法;讨论了最佳的成像条件和AFM的操作技术并对各种固定DNA的方法进行了比较和评估。

植物细胞中含有成百上千种蛋白质,占细胞干重的比例仅次于纤维素,是植物细胞的重要组成部分。蛋白质通过结构的改变——构象的变化来行使功能,人们采用很多手段分析蛋白质的结构和功能。而AFM在蛋白质研究中的应用成为电子显微镜(EM)、X射线结晶学(Xraycrystallography)和核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)技术的有力补充。膜蛋白的晶体结构解析是国际公认的难题,而光合作用相关蛋白历来是植物学家们关注的焦点。如2004年,我国科学家成功解析了菠菜(Spinaciaoleracea)主要捕光复合物LH-CⅡ晶体结构,这项成果引起了国内外学者的普遍关注(Liuetal.,2004)。利用AFM最早实现了对单个光系统Ⅱ颗粒及光系统Ⅱ衍生物的观测(Lyonetal.,1993;Shaoetal.,1997)。Kernen等(1998)采用Langmui-Blodgett(LB)技术分离捕光复合物,借助AFM了解到在单分子蛋白质和蛋白质脂质混合膜上存在类似环形的结构。然而Trudel等(2001)利用AFM和近场光学显微镜(SNOM)观察吸附在二氯苯脲膜上的光系统Ⅱ中心复合物(PSⅡCC)呈圆球状,推断前人所得环形结果的原因可能是由于力过大对样品造成了一定的损伤。ATP合酶为较大的蛋白复合体,它磷酸化ADP生成ATP。Seelert等(2000)在25mmol.L-1MgCl2、10mmol.L-1Tris-HCl、pH7.8、室温条件下对菠菜叶绿体ATP合酶亚基Ⅲ低聚物进行AFM成像,结果表明这种低聚ƒ0.3)nm,较宽的为(7.4�0.3)nm,而内径均为(3.5�0.3)nm,并且都存在14个亚基。他们又在脂双分子膜片段上重建亚基Ⅲ低聚物,测得脂双分子层的厚度为(4.1�0.2)nm,蛋白质的厚度为(7.6�0.2)nm,低聚物圆环尺寸与以前的实验结果一致(Seelertetal.,2003)。在室温下,接触模式观察到完整的菠菜叶绿体ATP合酶的最大外径同样为(7.4�0.3)nm,不完整的ATP合酶为(7.3�0.3)nm,出现不完整的ATP合酶可能是由于使用SDS凝胶所致(Mulleretal.,2001)。水通过脂双层膜所需的活化能大于细胞膜表面的活化能,由此产生了水通道假说。Fotiadis等(2001)借助扫描透射电子显微镜(STEM)和AFM观察PM28A和PM28C两种水通道蛋白亚型晶体,发现了两种不同的类型,一种是P4212对称,晶格矢量为a=b=(9.76±0.06)nm;一种是紧密堆积的四聚体六方晶格,晶胞的尺寸规格为a=b=(8.58±0.18)nm。对于其它蛋白质的AFM实验也相继进行。Leite等(2002)在液相下得到了Schizolobiumparahyba种子中的胰凝乳蛋白酶抑制剂低聚物的六角形、椭圆形、Z字型、彗星形、金字塔形共5种结构;Bittencourt等(2003)对一种植物胞浆蛋白Enterolobin的分子模型和AFM图像进行比较,取得一致的结果;在亲水表面测量玉米醇溶蛋白(zein)高度为40nm,粗糙度为6.97nm;疏水表面的蛋白高度均一,粗糙度为1.88nm(Wangetal.,2004);McIntire等(2005)采用非接触模式分析了六倍体转基因小麦(Triticumaestivum)高分子量麦谷蛋白亚基的结构(high-molecular-weightgluteninsubunits,HMW-GS);关于嘌呤吲哚蛋白基因PIN-a与二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)相互作用的研究结果表明,DPPC单层膜较亮处为液体压缩相(liquidcondensedphase,LC),较暗处为液体扩展相(liquidexpandedphase,LE),加入PINa后LE与LC相发生颠倒,其中LE相有大量浓厚的网状聚集,LC相出现众多球形凸起(Dubreiletal.,2003)。分子识别力学显微镜(MRFM)是一种特殊的AFM,应用MRFM对豌豆(Pisumsativum)血凝素(Pisumsativumlectin,PSL)、甘露醇结合血凝素(mannan-bindinglectin,MBL)和麦胚素(wheat-germagglutinin,WGA)3种植物血凝素的识别已获得成功(Kleinetal.,2003)。