AFM在生物领域发挥巨大作用

AFM可以在生理状态下观察任何活的生命样品和动态过程,主要有生物大分子之间的生化反应过程、病毒对细胞的感染过程、蛋白质的结晶析出等等,已被广泛地应用到生物样品中。

观察生物大分子之间的生化反应过程,对于研究生物的结构与功能有很大的帮助,有很多实验动态观察了DNA复制、转录和蛋白质的翻译过程,有些实验则观察DNA、RNA与酶结合过程,使人们对这些生化反应有了更进一步的了解。此外,AFM可以清晰地看到RNA聚合酶在DNA模板中运动,这种技术用于更大的分子,将会提高特异治疗药物插入的几率,那样很多疑难疾病的治疗就成为可能。病毒对细胞的感染是一个很典型的例子,应用AFM已观察了痘苗病毒感染单个细胞的过程。将痘苗病毒加入培养液后,细胞变得光滑柔软,在这种状态下病毒易于穿过细胞膜。

蛋白质从溶液中结晶析出也是一个十分值得关注的领域,人们采用AFM研究了溶菌蛋白、刀豆蛋白、Thaumatin蛋白、α2milase蛋白分子和过氧化氢酶的结晶情况。这些研究有助于人们更加深入地理解蛋白质晶体的生长动力学和成核机理。

用于各种生物力学的研究:将很高的空间分辨率与敏感且准确的力学感应性相结合,是AFM的一个极为显著的特点。通过将探针连接在弹性系数很小的悬臂上,AFM对力的测量敏感性可达到pN水平。AFM已经广泛用于测量生物分子间的相互作用,如核酸与蛋白质的相互作用、酶与底物的相互作用、抗原与抗体间的相互作用、受体与授体间的相互作用以及药物小分子和靶向中心的相互作用等。AFM力谱技术发展也比较快。利用AFM单分子力谱技术系统研究人工和天然短链DNA分子的开链行为,表明该技术可以分辨10个碱基对的特定相互作用力的变化情形。利用此技术已检测到单碱基突变引起的不同作用力,为定量表征和解释DNA单个序列提供了非常有价值的热力学模型。

利用AFM可对扫描各点的高度及作用力进行测量,这样不仅可以获取生物样品的表面形态和三维结构,还可以得到其表面硬度、粘弹性、摩擦力等力学特性的表面图谱。AFM在扫描样品时,探针尖端作用于样品,使样品产生可测量的凹陷,当应力与应变力呈线性关系时,样品发生的变形属弹性变化,撤消力时样品可恢复原有形态,利用凹陷的深度数据,就能够获取有关样品局部的弹性信息。利用AFM已测量了支气管上皮和肺泡上皮细胞在不同负荷力和作用频率下的复剪切弹性系数,观察了其变化规律。

AFM悬臂本身就是一种非常灵敏的传感器,能够监测生物传感器表面生物分子间的相互作用。利用AFM力谱能够响应浓度最低为10-18mol/L数量级的生物分子,这比传统的检测技术提高了8个数量级。AFM力谱的这种超高灵敏度,也为解决“监测单个生物分子及其络合物的结合与解离”的难题带来了希望。此外,人们经常利用生物分子功能化的AFM悬臂识别与样品中具有特定相互作用的相关分子。

用于生物样品的纳米操纵:目前原子、分子的纳米操纵已进入到生物大分子层次。对生物大分子的纳米操纵,不仅可以获得生物大分子特性的新信息和新的生物学方法,也为生物大分子的应用展示了更为广阔的前景。

与标准显微切割技术相比,AFM对目标区域切割、提取等操作具有更准确的特点。1992年人类首次使用AFM对生物分子进行可控性纳米操纵,随后它在生物膜的切割、待研究分子的分离等方面也得到广泛应用。到目前为止,我国科学家已实现了对DNA分子的人工拉直操纵,并可以把DNA排布成纳米尺度的二维网格,在此基础上,利用改进的“分子梳”方法,首次实现了复杂的体系———一种线性噬菌体病毒的人工拉直与定向。这种操纵是在大面积平整的固体表面实现的,并利用原子力显微镜,对拉直前后的病毒进行了观察与测量。

由于AFM的高分辨率以及可在生理条件下操作等优势,已经成为生物研究中不可或缺的工具。但是原子力显微镜在拥有诸多优点的同时,也存在一定的局限性。

首先,锥形针尖在使用过程中会变钝,尖端增宽,会导致分辨率下降,为了保证分辨率,就必须经常更换针尖。在观察样品后(尤其是液态中观察),针尖会被样品污染,再次使用需要清洗,并且针尖会对生物样本造成损伤。目前有一种解决方法是使用碳纳米管针尖,由于碳纳米管直径小,杨氏模量大,力学强度高,结构精细,并具有独特的化学特性,而成为理想的探针材料,已广泛应用于生物分子、生物结构等研究领域。

其次,在观察液态标本时,由于表面张力和静电斥力等因素会产生干扰信息,使得分辨率下降。为了解决这一问题,有实验室提出改变溶液pH值可清除静电斥力,但有明显的局限性。采用静电平衡法可解决这一问题。

最后,由于AFM本身的局限性,很多功能必须与其它设备结合。对于纷繁复杂的生命系统,仅靠一种设备显然是不够的,AFM必须与其它设备或技术手段如近场显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光显微技术、X2射线衍射、抗体标记、表面干涉等有机结合,方能更有效地探索各种生命系统。综上所述,随着原子力显微镜的发展,如针尖技术的改进,表面张力、静电斥力等测量因素的消除,以及与其它设备的结合等,AFM必将在生物领域发挥更大的作用。