原子力显微技术应用于研究受体-配体间的相互作用

近年来,许多新技术已直接用于蛋白质等生物分子之间相互作用力的测量,其中以原子力显微技术对生物分子间的作用的测定最为简便和最具有实用性。以往通常采用生物化学方法如亲和力实验或结合速率常数来测定受体<配体间的相互作用力。尽管这类测量方法在研究受体<配体间的相互作用中仍然占据重要地位,但它们却不能提供在内力及外力影响下受体<配体之间相互作用的动态变化信息。例如血流影响游移白细胞黏附于血管内皮,当细胞沿血管滚动时,这一外力使黏附受体经历黏附和去黏附周期。目前,这一研究领域已扩展到测定生物分子在外力作用下的机械性质。AFM是作为一种成像工具而设计的,但还能以力扫描方式进行操作。在这种力模式下,它能以10-12N(pN)的精度测量两相对表面之间的作用力,如受体<配体之间的结合力。在受体<配体间作用力的研究中,配体被偶连于AFM的弹性悬臂表面,受体则被固定于适当的基底表面。在悬臂接近和离开基底的过程中,通过悬臂的偏折便可测得受体<配体间的作用力。这一新的应用使AFM成为检测生物分子间相互作用的一种超高灵敏度的力传感器。本文介绍受体<配体间相互作用的影响因素&实验方法及方案,并简要介绍几例AFM在这方面的应用。

配体或受体必须固定于AFM尖端，才能对受体<配体对之间的作用力进行测定。将配体或受体固定于探针尖端，使其具有与基底上的受体发生相互作用的能力或性质的过程，称为探针尖端的功能基化。由于各种要测定的分子的性质不同，探针尖端功能基化的方法各异，但通常所用的技术涉及化学吸附或者用一个延长的连接体将配体共价连接于探针的尖端_ba。化学吸附的特点是简便易行，但许多需要测定的配体不能直接吸附于探针尖端，或由于吸附力弱而易于脱落。通过一个中间连接体将配体共价连接于探针尖端，则大大拓宽了可用?AFM进行力学测定的受体<配体分子对的范围，许多能与连接体发生共价结合的物质分子都可以对探针进行功能基化。另外，针尖与配体间的连接体使之具有更大的活动性，以接近于被探测的受体表面。为了能够与偶连于针尖的配体。受体）发生作用，还需将受体。或配体）固定在基底表面。将受体或配体固定于?AFM基底的方法很多，包括直接吸附&共价连接和通过某种介质进行吸附或共价连接等。在开始固定过程之前，首先要考虑的问题是要选择什么样的基底。可用作受体<配体间相互作用研究的基底的材料很多，一般有云母&石墨&盖玻片，但较常用者为琼脂糖珠。作为测力的基底，琼脂糖有几个诱人的特征。首先，琼脂糖基质对许多蛋白的亲和力很低，使非特异的相互作用保持在最低水平。其次，蛋白易于与活化的琼脂糖偶连。最后，有弹性的琼脂糖基底能适应悬臂尖端的形状，以增加接触面积，提高受体<配体相互作用的几率。将配体偶连于AFM针尖后直接对细胞表面的受体进行受体)配体间作用力的探测是近几年来受体)配体间作用力研究的趋势，然而活细胞表面远比用蛋白包被的琼脂糖珠或云母表面要复杂的多。而且细胞表面受体的低密度及非特异性相互作用使其更具挑战性，虽然如此。检测配体与活细胞上受体间的相互作用对于许多研究者仍具有诱人的魅力，其原因是多方面的。但主要有#，直接在细胞表面测定。省去了受体提纯的复杂过程。。在培养皿中培养的细胞。可直接以培养皿为基底进行测定。避免了将受体固定于基底表面的诸多困难。#活细胞表面的受体。保持着天然状态下的良好活性。使结果更为接近生理状态下的实际情况。因而其结果更具有实用意义。。在活体细胞表面进行观察。可以实时地研究整体细胞对受体)配体间相互作用的综合反应，由于在活细胞上进行测定的这些优越性。研究者在对力的分析方面多花些精力也在所不惜。

通过对AFM探针进行功能化修饰，使针尖表面带有特定的功能团，能够进行生物大分子之间作用力的测量&表面组分成像等，实现了在纳米范围内化学反应特性的研究，为生物大分子功能的研究&微小机械的开发奠定了基础。总之，现在的AFM已成为集观察和分析于一身的多功能显微镜。最近几年，AFM的使用已使我们获得了大量可靠的信息。随着科技的不断发展&仪器的不断更新，AFM必将在生物大分子结构&动力学和相互作用的研究方面发挥更大作用。